[論文] 白藜蘆醇保護腦血管內皮細胞

摘自台北醫學大學.醫學研究所論文

腦血管內皮細胞(cerebrovascular endothelial cells ; CECs)是血腦屏障(blood brain barrier)的組成之一，血腦屏障能避免有害物質侵入腦部引起傷害。氧化態低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein；oxLDL)已被證實會傷害血管內皮細胞，進而造成粥狀動脈硬化(atherosclerotic)，但對腦血管內皮細胞的影響則尚未被證實。

白藜蘆醇(resveratrol)是一種存在葡萄中的多酚類物質，具抗氧化功能並對預防或改善心血管相關疾病有作用，但是能否保護血腦屏障免於oxLDL的傷害則尚無相關研究。本研究將以小鼠CECs為研究模式探討白藜蘆醇如何保護CECs免於oxLDL的傷害，及其可能機制。

首先以人的LDL (Low density lipoprotein；LDL)用不同濃度的硫酸銅於不同時間點下培養，偵測氧化程度的差異，結果發現硫酸銅濃度越高，處理時間越長，則會使LDL氧化越嚴重。利用3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5–diphenyltetra -zolium bromide (MTT)色度分析法來檢驗細胞粒腺體內膜琥珀酸去氫?(succinate dehydrogenase)的活性，發現200 μg/ml的oxLDL處理CECs 48小時會使其存活率降低至58.7 %，同時觀察到CECs型態由原先的紡錘狀皺縮為圓形、以trypan blue染色也發現活性下降45.9 %，並有DNA片段化現象的出現，證實oxLDL具有引發CECs細胞凋亡(apoptosis)的能力。再以反轉錄聚合?連鎖反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction)方法分析CECs內oxLDL的受體(lectin-like oxLDL receptor-1；LOX-1) mRNA，發現CECs與oxLDL共同培養後，LOX-1 mRNA的表現量上升。此外由2’,7’- dichlorofluorescin diacetate (DCFHDA)偵測細胞中反應性氧分子(reactive oxygen species；ROS)的含量，利用西方點墨法(western blotting)以及caspase酵素活性分析進一步證明細胞凋亡的機制是透過減少bcl-2使粒腺體膜通透性上升，增加bax與cytochrome c蛋白表現與活化caspase 9、caspase 3、caspase 8。

白藜蘆醇在非細胞實驗中顯示具有抑制LDL氧化的效果，10 μM的白梨蘆醇並不影響CECs的型態和存活率。將CECs同時處理200 μg/ml的oxLDL與10 μM的白藜蘆醇後發現，細胞型態仍呈現紡錘狀、細胞存活率由54.1 % 回升為83.6 %，另外DNA裂解程度減低，證明白藜蘆醇對oxLDL造成的細胞凋亡有保護的作用。進一步探討保護作用的機制，發現LOX-1 mRNA的表現不受白藜蘆醇影響，白藜蘆醇對抑制ROS的產生、降低粒腺體膜通透性、減少cytochrome c蛋白量的表現與抑制caspase 9、caspase 3及caspase 8的活性均有作用。

由本研究成果可知，白藜蘆醇保護CECs的機制並非透過影響oxLDL進入細胞的過程，而是在LDL的氧化過程中藉由本身抗氧化能力減輕脂質氧化程度，並降低因為oxLDL的進入導致上升的ROS，減輕其對細胞產生的破壞。不但會調控外生性的細胞凋亡路徑減少caspase 8產生；也影響內生性細胞凋亡路徑，減少bax的產生，增加bcl-2使粒腺體膜通透性上升、cytochrome c釋出量減少、caspase 9及caspase 3活性降低，來對CECs達到保護的作用。